발표과제인데 일주일 넘게 한글,영어로 구글링, 도서관 서적,교수님께 질문을 하여도 도저히 이해가 되지 않는게 있어 과게까지 오게 되었습니다.ㅠㅠ
저는 고등학교 때 생물을 좋아했지만 화학은 싫어하던 학생인지라 화학용어나 기본상식에 좀 부족한 점 양해해주시길 바랍니다.
과제의 주제는 비타민 B1,B2의 정량분석법에 관하여 설명을 해야하는 것입니다.
그 과정에서 많은 용액들을 넣는데 저는 그 용액을 어떠한 이유로 넣는지 알고 싶습니다.
학교교재의 티오크롬법,리보플라빈법이 구글이나 다른 서적과 달라 각종 조사에도 그 이유를 알 수가 없었습니다.
교수님께도 왜 넣는가 질문하였으나 '실험에는 왜?가 없다. 그냥 하는 것이다. '라는 답변만 들었습니다....;;
진짜 왜가 없나요??ㅠ
먼저, 학교교재의 티오크롬법, 리보플라빈법을 쓰는게 과게분들이 더욱 이해하시기 편할 것 같아 교재의 내용부터 쓰겠습니다.
제가 이해가 안되는 부분이나 이해하고 있는 내용을 다른 글씨색으로 쓰겠습니다!
잘못 이해하고 있는 사항이 있다면 알려주시면 감사하겠습니다!!
티오크롬법
재료
시료: 티아민(비타민B1),고급 에탄올, 에탄올, potassium ferricyanide[K3Fe(CN)6], NaOH, 이소부틸알코올, NaCl, 돼지고기, 현미
고급 에탄올과 그냥 에탄올은 왜 나누는 건가요...?
thiamin(비타민B1)표준용액:
thiamin·HCl을 20%의 에탄올(pH 3.5~4.3)에 10㎍/ml가 되도록 용해시킨다.
thiamin용액에 0.1N HCl 50ml를 가하고 95~100℃에서 30분간 끓인 후 냉각시켜 0.1N HCl용액으로 100ml가 되도록 희석한다.(1㎍/ml)
산화제: 1% potassium ferricyanide[K3Fe(CN)6] 4ml를 15% NaOH와 혼합하여 100ml로 만든다(사용직전에 만들어 사용)
기기: 원심분링요 시험관, 형광광도계
방법
1. 현미와 돼지고기 10g을 파우더 또는 걸쭉한 형태로 잘 갈아서 10배정도의 부피의 0.1N HCl을 가하고 95~100℃로 30분간 자주 흔들면서 끓인다.
비타민B1을 침출하기 위해 하는 것
2. 냉각한 다음 0.2~0.5㎍ 티아민/ml가 되도록 0.1N HCl로 1.5~2배 희석한다.
이것또한 비타민B1을 침출하기 위한 것인가요? 희석하는 것이라면 비타민B1이 산성에서 안정적이기에 산성으로 희석해주는 것인가요?
3. 원심분리관 6개에 labelling을 하고 원심분리과 1,2에는 현미시료 용액을, 원심분리관 3,4에는 돼지고기 시료를,
원심분리관 5,6에는 티아민 표준용액 5ml씩 취한다.
4. 각각의 원심분리관에 NaCl 1.5g을 넣어준다.
비타민 B1을 알칼리성에서 산화시키면 티오크롬이 되기때문에, 알칼리로 만들어주기 위해 첨가.
5. 원심분리관 1,3,5에 potassium ferricyanide[K3Fe(CN)6] 3ml를 넣고 잘 흔들어 준다. 그리고 isobutyl alcohol 13ml를 넣고 vortex하여 준다.
6. 원심분리관 2,4,6에 NaOH용액 3ml를 넣고 잘 흔들어 준다. 그리고 isobutyl alcohol 13ml를 넣고 vortex하여 준다.
위에서 만든 산화제는 어따 버리고 따로따로 넣는건가요?
7. 각 원심분리관에 isobutyl alcohol을 적당량을 가한 후, 2분간 잘 흔들어준 다음 1000rpm에서 원심분리한다.
isobutyl alcohol은 알코올이니까 가벼워서 결합시켜 비타민B1을 상등액으로 뜨게 해주기 위해 첨가.
8. 각 원심분리관으로부터 상등액을 얻어서 10ml를 취하여 티오크롬의 형광을 큐벳을 사용하여 365nm와 435nm에서 형광을 측정한다.
원심분리관 1,2,3,4,5,6등의 상등액의 형광을 측정한 값을 1',2',3',4',5',6'라 한다.
왜 서로 다른 형광에서 측정하나요? 365nm,435nm에서 각각 측정했다면 12개의 값이 나와야하는거 아닌가요?
현미시료 용액 5ml내의 비타민B1(㎍) = 1'-2' / 3'-4' 이다.
돼지고기 시료용액 5ml 내의 비타민B1도 같은 방법으로 측정.
이 계산식도 이해가 안 갑니다ㅠㅠ 표준용액은 현미와 돼지고기 시료의 값과 비교하기 위해 만들어준건가요? 계산식에 안 쓰여서요
리보플라빈법
재료
시료: choloform(형광성이 없는 것), 1N-HCl, 1N NaOH, 빙초산, 우유, KMnO4, H2O2, NaS4O4
리보플라빈 표준용액: 리보플라빈을 1% 초산으로 25㎍/ml의 농도가 되도록 만든다. 원액 1ml를 50배 희석하여 정량용 표준용액으로 사용한다.
기기: 추출병(갈색병), 광분해 장치: 상부에 형광등을 붙이고 측면에 빛이 난사되도록 만든 상자, 형광광도계, 원심분리관
방법
1. 우유 25ml를 100ml의 플라스크에 넣고 0.1N HCl를 가하여 80℃의 물을 가한 다음 80℃ 중탕기에 넣고 20분간 혼합하면서 가열한다.
리보플라빈(비타민B2) 추출을 위해 산성에서 가열.
2. 시료를 냉장고에 넣어 10분간 냉각시킨 후 잘 교반하면서 NaOH를 넣어 pH 6.0이 되게 하고 그 다음에 1N HCl을 넣어 pH 4.5가 되게 하여준다.
시료에 물을 넣어 100ml로 만들어 주고 여과한다.
이것도 리보플라빈 침출을 위한 것?. 그런데 왜 알칼리로 만들었다가 다시 산성으로 만드나요? 여과하는 이유는?
3. 여과액 50ml에 1N HCl을 떨어뜨려 침전이 생기지 않게 되면 중지한다. 그리고 같은 양의 1N NaOH를 계속 저으면서 떨어뜨려 준다.
이건 왜 해주는 건가요?
4. 물을 넣어서 시료를 100ml로 부피를 맞추어 준다.
위의 HCl과 NaOH를 부어주며 사라진?(정확한 용어를 모르겠네요ㅠㅠ) 부피를 맞추어 주기 위해
5. 원심분리관 1,2에 각각 시료를 10ml, 물 1ml를 넣어 섞어 주고, 다른 2개의 원심분리관 3,4에 시료 10ml를 넣고
정량용 비타민 B2표준용액 1ml(0.5㎍)을 넣고 잘 섞어 준다.
표준용액은 왜 섞어주나요...
6. 원심분리관 1,2,3,4에 각각 1ml의 빙초산을 가하고 잘 섞은 다음, 3% KMnO4 용액을 0.5ml를 넣고 2분간 놓아둔다.
빙초산은 비타민 B2을 용출하기 위해, KMnO4 은 비타민B2이외 유기물(형광물질)을 제거시키기 위해
7. 그리고 H2O2 0.5ml를 넣고 잘 섞어준다. 이때 적색이 나타나는데 곧 바로 없어져야 한다. 주시험의 형광을 측정한다.
과잉의 KMnO4를 분해하기 위해 첨가. 적색은 왜 없어져야 하는가? 주시험이 어떤 원심분리관을 뜻하는 건가요?
8. 약 20mg의 NaS4O4를 섞고 10초 이내에 형광을 측정한다. 그리고 첨가 실험의 형광을 측정한다.
산화된 리보플라빈(비타민B2)를 환원시켜 주기 위해, 첨가시험은 어떤 원심분리관인가요?
클로로포름은 도대체 어디로 사라졌나요..
시료 1g 중의 비타민 B2(㎍/g) = (A-C / B-A ) x (0.5 / 10) x (100 / 50) x 100 x (1 /a) = A-C / B-A x 10 / a
A: 주시험의 측정치 B: 첨가시험의 측정치 C: NaS4O4를 섞은 후의 측정치 a: 시료 채취량
NaS4O4를 섞은게 첨가 실험 아니었나요? 티오크롬법보다 이게 더 이해 안 가요ㅠ
질문이 많아서 죄송합니다ㅠㅠㅠㅠ 발표하려면 제가 이해해야 하는데 이해가 도저히 안돼요...
알려주신다면 정말정말정말정말정말정말정말정말정말 감사드리겠습니다!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
제 생명의 은인 입니다!!!!!!!!!!!!!!!!
본인삭제금지
글쓰기